《科学》颠覆性突破！哈佛大学顶尖华人学者发明细胞照...

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引言
最新一期的国际著名期刊《科学》杂志发表一篇重磅文章，由著名华人科学家、2017全球十大科技突破入选者、哈佛大学David Liu教授和学生唐微信（音译：Weixin Tang）两个人发表，他们采用CRISPR技术来记录细菌或者细胞对抗生素、营养物质、病毒、光等的信号改变。
第三代基因编辑技术CRISPR-Cas系统到了现在，应用之广泛恐怕早已经超越当初这个领域中许多人的想象了。这一周在著名期刊《科学》杂志上面的三篇重磅文章可能又把这一领域推向高潮，既包括张锋团队以及杜德拉团队的关于应用CRISPR技术进行超灵敏基因检测的两篇文章（欢迎查看本公众号原创文章：两篇《Science》首发：麻省理工张锋和加州伯克利美女教授杜德拉再度陷入火拼！基因检测灵敏度前所未有）；还有一篇就是这里将要介绍的，哈佛大学David Liu教授和博士后Weixin Tang的利用CRISPR技术记录细菌或者细胞对抗生素、营养物质、病毒、光等的信号改变的方法。


▲David Liu教授和博士后Weixin Tang在著名学术期刊《科学》杂志上面发表的文章这项被研究者们叫做“CAMERA”的技术可以说是CRISPR领域的又一大重大突破！不但《科学》杂志在最新一期中配发了相关的评论“‘CAMERA’ records cell actionwith new CRISPR tricks”；另一著名学术期刊《Nature》也在第一时间发表了相关报道“CRISPR hack transforms cells into data recorders”。足见科学界对这项创新性生物工程及信息技术的重视程度。

▶记录细胞的历史◀人类有历史，从古至今的迁徙演变；动物也有历史，比如你养的小宠物，从小养到大甚至老去；植物也有历史，比如门前的大树，你小时候见到它恐怕又细又矮。细胞有没有历史呢？答案是肯定的，因为细胞也有从诞生到衰老死亡的过程。人类记录自己的成长历史，比如一个小孩子从出生到老去，那非常好办，有照相机或者录像机就可以解决问题。


要记录一个细胞的衰老死亡，从表面上看也比较容易，只需要在显微镜下面拍照或者录像就行了。然而，要记录细胞或者细菌在遇到刺激比如营养物质、光、热、抗生素、病毒等等的时候，细菌或细胞究竟发生了什么？激起了哪些信号通路或者分子的变化？等等，这些分子层面的东西，要记录下来那是相当不容易，一方面你用显微镜观察也很难看见，另一方面，细胞经历了这些变化之后，经过一段时间可能又恢复了正常了，因此，你很难判断细胞的历史（Cell' History）中是否经历过上述变化。要记录这些变化，那就要用到下面将要介绍的哈佛大学David Liu教授和博士后Weixin Tang的利用CRISPR技术改造的名叫：CAMERA的技术了。


▲基因编辑技术大咖David Liu教授，发明了基于CRISPR的单碱基编辑技术，从而把第三代基因编辑技术推向又一高峰（图片来自网络）
▶CAMERA一代◀这项广受关注的技术叫做CAMERA，照相机的意思，是CRISPR-mediated analog multi-event recording apparatus的首字母缩写。再一次说明，David Liu教授深得取名字的精髓，确实，名字取好了便于科学传播。如何在细胞中记录信号？研究者们在CAMERA一代（实际上是CAMERA1.1）中，把CRISPR-Cas9基因（spCas9）和表达sgRNA（引导RNA）都同时构建到一个质粒中，而Cas9基因和sgRNA的前面都放入小分子化合物诱导表达的启动子（常用的TetO启动子，需要四环素诱导表达，anhydrotetracycline，aTc；而LacO启动子则需要化合物IPTG的诱导）。


▲spCas9基因表达的表达受到小分子化合物诱导启动子的控制，比如，需要spCas9蛋白的话，就必须要加入四环素（anhydrotetracycline，aTc）这个化合物，有这个化合物就有spCas9表达，这样一来就能够在特定位置剪切DNA，而要是没有这个化合物spCas9就不表达，这样就不能够在特定位置剪切DNA（图片来自Science）

因此，spCsa9的表达受到四环素aTc的控制，而sgRNA的表达则受到IPTG的控制；换句话说，环境中的四环素这种抗生素就能够刺激spCas9的表达，而环境中的IPTG这种小分子就能够刺激sgRNA的表达。因此，要是环境中既存在四环素，又存在IPTG，那么，就会产生spCas9蛋白和相应的sgRNA。产生spCas9和相应的sgRNA有什么用呢？众所周知，这两样东西一结合，就会在特定的基因或者DNA序列位置剪切DNA。然而，直到这里也没有什么新意，这本来就是CRISPR-Cas系统干的事情。但是，这里不得不注意一点，不知道你有没有注意到，对于细菌而言，通过上面的诱导型操作就将四环素和IPTG这样的化合物转变成了spCas9和sgRNA这样的信号，进一步就变成了切割DNA的工具。而spCas9和相应的sgRNA结合之后，要切割什么DNA序列呢？这就是CAMERA技术的关键了。



▲CAMERA技术的原理图（注意R1与R2的三个碱基序列不同）研究者们将绿色荧光蛋白（EGFP）（发绿色荧光）基因以及仅有三个碱基不一样的突变绿色荧光蛋白（mEGFP）（不能发荧光）基因构建到质粒中，分别称为recorder plasmid1（R1）和recorder plasmid2（R2），作为记录质粒（见上图）。然后把这两种质粒R1和R2按照一定拷贝数量比例（比如R1：R2为58:42）转入细菌（或细胞）中，此时，细菌（或细胞）就发强烈的绿色光（由于R1这种表达正常荧光蛋白的质粒多一些）；然而，一旦上面所述的spCas9和相应的sgRNA（专门靶向结合正常的未突变的EGFP基因的）结合之后，spCas9-sgRNA复合物就会结合到R1质粒的EGFP序列上，剪断EGFP的序列，结果就使得R1质粒不能够表达绿色荧光蛋白了，这样一来，细菌（或细胞）就会在荧光显微镜下变得看不见（因为细菌中表达正常绿色荧光蛋白EGFP的R1质粒被破坏了）（当然，实际上可能是变得暗淡）。因此，细菌由强烈的绿色光转变为没有绿色荧光，这就是信息学上面的“逻辑门”（1,0）的概念，有绿色光代表1，无绿色光代表0。这就如同电灯泡，电灯泡亮着，就意味着有人还在，可以用1来表示；而一旦关灯，就意味着这个人要休息了，可以用0来表示。



因此，开灯和关灯就是一种信号；类比到这里，绿色荧光到没有荧光就是一种信号。现在来复盘一下：四环素和小分子化合物IPTG共同刺激细菌，就产生了spCas9和针对EGFP的sgRNA，而它们一旦结合，就会剪切发绿色光的R1质粒，进一步造成R1质粒数量变少（甚至没有），从而导致细菌不能发光。这样一来，四环素和IPTG对细菌的刺激就一步步变成了绿色光转变成无光，因此，抗生素等化合物的信号就转变成了光信号。现在来逆推一下：细菌由发强烈的绿光转变成不发光，意味着什么呢？这就意味着细菌同时感受到了四环素和IPTG这两种化合物的刺激。因此，我们只需要观察到细菌由绿色变成没有颜色，我们就能够知晓细菌受到了抗生素（四环素）和化合物IPTG的共同刺激（当然，这里必须注意的是，实际上也可以不需要观察荧光，而直接采取测序的方法测定R1和R2质粒的拷贝数比例的变化也能够知晓细菌受到抗生素和IPTG的刺激没有）。

▶CAMERA二代◀实际上，上面的CAMERA一代相当的繁琐，一方面，虽然观察绿色光信号比较容易，但是谁没事在那显微镜下一直观看细菌（或细胞）发光呢？另一方面，虽然也可以通过测定R1质粒和R2质粒的比例来确定细菌受到抗生素和小分子化合物刺激没有，但是这个R1质粒和R2质粒的初始比例却非常难掌握，需要做很多实验来确定这个比例。简而言之，

CAMERA第一代太麻烦了，有没有更简单的方法呢？当然是有的，这就是升级版的CAMERA二代，这其中就需要使用David Liu实验室独家秘籍，一种叫做单碱基编辑（Base Editor）的CRISPR技术了（了解相关内容欢迎查看本公众号原创文章《自然》《Science》黑科技单碱基编辑技术会是下一个生物医学科研和应用金矿吗？）


▲CAMERA2技术的原理图（主要利用了David Liu实验室的独门技术：单碱基编辑技术Base Editor）这个CAMERA第二代简单说来就是：你外界的物质（比如抗生素）刺激细菌（或细胞）一下，细菌携带的单碱基编辑器（Base Editor）就在特定的基因组中不重要的位点（比如某内含子中）替换一对G-C变成A-T，这样一来，一旦在特定位点通过测序测定到原先的碱基G-C变成了A-T，那么，就可以确定细菌（或细胞）受到了抗生素的刺激了。因此，外界的抗生素等化学物质就转变成了基因突变信号，你来一个刺激，细菌细胞中的单碱基编辑器Base Editor就给细胞中的基因组打上一个突变（G-C到A-T），因此，我们只需要检测特定位置（比如基因组中某基因第2000个碱基）发生了G-C到A-T突变就可以判断细菌曾经遭受过什么刺激。这不得不说太方便了，就像到医院去体检，几十个体检项目，检测完一个就盖上一个章，只需要看有没有盖章就能够判断你检测这个项目没有。“（这项工作）is really beautiful stuff”，麻省理工著名华人科学家卢冠达（Timothy Lu）博士在《科学》杂志采访时评价到。这项工作可以说是意义非凡，期待后续进展。


参考资料：1. Rewritable multi-event analog recording inbacterial and mammalian cells.2. [url=http://science.sciencemag.org/content/359/6377/7283.https://www.nature.com/articles/d41586-018-02068-0]http://science.sciencemag.org/content/359/6377/7283.https://www.nature.com/articles/d41586-018-02068-0[/url]



来源：转化医学平台